PCR溶解曲线的制作通常涉及以下步骤1:
准备标准品并进行稀释。通常需要制备5到6个不同浓度的梯度,稀释倍数一般选择5倍或10倍。
将稀释后的标准品作为模板进行实时荧光定量PCR(Real Time PCR)反应,以获得各个标准品的Ct值(循环阈值)。
利用Ct值与起始模板浓度的对数值之间的线性关系,制作标准曲线。这一步骤通常由仪器自动完成,无需人工操作。
评价标准曲线的优劣主要通过两个指标:相关系数(R²)和斜率。理想的相关系数应大于0.98,越接近1表明直线性越好,定量越准确。斜率反映PCR扩增效率,理想值在0.8到1.2之间,越接近1表明扩增效率越理想。